1995年、東京大学で開催された重点領域研究^*1「神経可塑性の分子機構」の班会議の終了後、同大に異動していた班長である三品先生のラボを訪れた。そこで出会ったのがドイツ留学から帰って間もない狩野方伸先生で、帰りがけに東京駅の地下街で軽く飲んだ。彼との出会いはその時が初めてで、以前から付き合いのあった新潟大学の崎村先生も加わり、以後30年間続く発生工学―神経生理学―神経解剖学の濃密な連携によるシナプス回路発達の共同研究が始まった（図１）。

図１　発生工学（崎村建司、左）―神経生理学（狩野方伸、中央）―神経解剖学（筆者、右）によるシナプス回路発達研究のトライアングル。

それぞれのラボメンバーも加えると、それなりの規模の研究体制が構築された。米国ワシントンDCにて撮影。

　間もなく、私の下に遺伝子欠損マウスが次々と届けられ、瞬く間に「mGluR1（Kano et al., 1997）Gαq（Offermanns et al., 1997）PLCβ4（Kano et al., 1998）PKCγ（Kano et al., 1995）シグナル伝達系による登上線維シナプス刈込みの分子機構解明」という神経科学の金字塔的研究成果が組み立てられ、世界に冠たる狩野ラボが確立した。この一連の共同研究において私がやったことは、「平行線維シナプスは正常に形成されている」ことを示す電子顕微鏡解析のみで（図２）、それ以上何もすることがなかった。同時期に進めていたGluD2遺伝子欠損による平行線維シナプス形成異常に関する形態生物学的研究に比べると、実にやりがい感が乏しい退屈な共同研究であった。
今回のコラムは、平行線維シナプスの形成と登上線維シナプスの刈込みの関係から話を始めたい。

図2　mGluR1欠損マウス（左）と野生型マウス（右）小脳の電子顕微鏡写真。

平行線維シナプス（矢頭はプルキンエ細胞スパイン、星印は平行線維終末を示す）の数的な違いは認められない。また、GluD2欠損マウスに見られたようなフリースパインや、プレ・ポストの結合ミスマッチなどの形態の質的異常も認められない。（筆者作成図）

平行線維シナプスの形成と登上線維シナプスの刈込み

　コラム6において、私が赴任した北大解剖学教室には、リーラーマウス^*2、ウィーバーマウス^*3、スタゲラーマウス^*4などの自然発症の小脳奇形マウスがいて、研究に用いていたことに触れた。特定の遺伝子を人為的に改変した個体を作成する技術が一般化する1990年代よりも前の時代は、遺伝子の突然変異により表現型が変化したマウスやラットを維持し系統化し、これを愛玩動物として飼育したり（寺島、2020年）、天与の研究材料として用いていた(Sotelo, 1990)。上記の小脳奇形マウスは、細胞移動障害、小脳の顆粒細胞死、プルキンエ細胞樹状突起の分化異常とそれぞれ病因は異なるものの、顆粒細胞とプルキンエ細胞の間にできる平行線維シナプスの形成障害が起こるという共通点があった。フランスの研究者たちがこれらの小脳奇形マウスの登上線維支配を電気生理学的に調べたところ、幼若期に見られる多重支配が残存していることを発見した（Crepel, 1982; Mariani, 1982）。これにより、「余剰な登上線維シナプスの刈込みには平行線維シナプス形成が必須である」という概念が提唱され、樹立されていた。平行線維シナプス数が半減し登上線維の多重支配が残存するGluD2欠損マウスも、これら古典的小脳奇形マウスと同じ部類に属する。
　これに対して、狩野先生らが明らかにしたmGluR1シグナル伝達系の欠損マウスは、「平行線維シナプス形成が正常であっても、登上線維シナプスの刈込み障害が起こる」ことを示す最初のモデル動物となった。この発見により、余剰な登上線維シナプスの刈込みを駆動する機能的分子実体がmGluR1シグナル伝達系であり、その活性化のために十分な数の平行線維シナプスの形成が必要であったと理解できる。要するに、登上線維シナプスの刈込みを駆動する分子機構は、GluD2に代表される平行線維シナプス形成を促進するシナプス接着機構と、平行線維終末から放出されるグルタミン酸により活性化されるmGluR1シグナル伝達機構の2段階からなっていることが判明したのである。

mGluR1シグナル伝達系

　mGluR1はプルキンエ細胞に豊富な代謝型グルタミン酸受容体^*5で、その活性化は細胞内カルシウムストアからのCa²⁺放出や、蛋白リン酸化反応を引き起こす。シナプス後電位の発生に関わるイオンチャネル型グルタミン酸受容体がシナプス結合部のシナプス後膜に密集するのに対して、mGluR1はスパインのシナプス外膜に存在し、特にシナプスの後膜と外膜の境界部（ペリシナプス）に密集するという特異な分布特性を有する（Baude et al., 1993）。
　mGluR1に共役するGqタンパク質と、Gqタンパク質αサブユニット^*6により駆動される効果器酵素のホスホリパーゼCβ^*7（PLCβ）には、それぞれ4種のサブタイプがある。そのうちGαqとPLCβ4がプルキンエ細胞にドミナントなサブタイプである（図３）。いずれも、mGluR1と同様にペリシナプスに集積する分子局在を示し、ここで情報伝達のためのシグナローム^*8を形成している (Tanaka et al., 2000; Watanabe et al., 1998; Nakamura et al., 2004)。PLCβ4により細胞膜のイノシトールリン脂質が分解され、ジアシルグリセロール（DAG）とイノシトール3リン酸（IP₃）という2つのセカンドメッセンジャーが生成される。IP₃は細胞内カルシウムストアであるER膜上のIP₃受容体に結合し、Ca²⁺放出を媒介する。一方、DAGとCa²⁺によりCキナーゼ^*9（PKC）が活性化し、蛋白リン酸化反応が亢進する。PKCにも数種類のサブタイプが存在するが、PKCγや-PKCαがプルキンエ細胞に豊富に発現し（図３）、活性化に際して細胞質から細胞膜にトランスロケートしてDAGと結合する。
　これらmGluR1、Gαq、PLCβ4、PKCγの遺伝子欠損により、平行線維シナプスは正常に形成されるにも関わらず、登上線維の多重支配が残存するという共通の表現型を捉えたということである。

図３　プルキンエ細胞に豊富なmGluR1シグナル伝達系

マウス脳矢状断切片を用いたin situハイブリダイゼーション解析によるmGluR1、Gαq、PLCβ4、PKCγをコードするmRNAの発現。（筆者作成図）

mGluR1シグナル伝達系と登上線維シナプス刈込み

　生まれたばかりの新生児マウスでは、プルキンエ細胞の細胞体は同様のシナプス強度を持つの数本の登上線維により多重支配されている（Hashimoto and Kano, 2003）。生後3日目 (postnatal day 3:P3) からP7までの間に、その中の一本の登上線維に選択的な機能強化が起こり、活動性に強弱差が現れる（Hashimoto and Kano, 2003; Kawamura et al., 2013）。P9になると、強化された「勝者」の登上線維のみが、成長伸展する樹状突起を這い上がり、神経支配領域を拡大する（Hashimoto et al., 2009; Carrillo et al., 2013; Ichikawa et al., 2016）。一方、細胞体に残った「勝者」と「敗者」の登上線維シナプスはP8からP17頃までに排除される。この細胞体シナプスの刈込みにおいて、P12前後から始まる後期刈込み過程において、平行線維シナプス形成とそれに引き続くmGluR1シグナル伝達系の活性化が主要な役割を果たしているのである。
　GluD2欠損により多重支配を招く余剰な登上線維シナプスは、フリースパインが生じる遠位樹状突起を標的として異所性支配が生じ、いわゆる「遠位型」の多重支配が起きることは前回のコラムで紹介した。それでは、mGluR1シグナル伝達系の欠損による登上線維の多重支配は、どこでどのようにして起こるのか？これに答えるための形態生物学的解析を開始して20年程経過しているが、定年退職を向かえる今年になって論文投稿の目処が立ってきた。論文が受理された後で、ここに追記する予定である。

mGluR1シグナル伝達系と平行線維シナプス刈込み

　プルキンエ細胞における平行線維と登上線維による興奮性シナプス回路の特徴は、遠近方向に分離した支配テリトリーと登上線維の単一支配である。支配テリトリーの分離が、平行線維シナプスの刈込みにより生じることを見つけた（Ichikawa et al., 2016）。
　野生型マウスのプルキンエ細胞を支配する平行線維シナプスと登上線維シナプスを、連続電子顕微鏡観察法によりP7～P30まで追求した。「勝者」の登上線維が樹状突起に這い上がるP9よりも前の段階では、樹状突起のほぼ全域を平行線維シナプスが支配している。この状態は、「勝者」の登上線維が樹状突起に這い上がった後のP15まで続くため、P9～P15の樹状突起は平行線維支配と登上線維支配が仲良くオーバーラップしている。P20になって初めて、樹状突起近位部から平行線維シナプスが刈込まれし、登上線維支配と平行線維支配が遠近方向に分離するのである。平行線維シナプスが刈込まれた証拠に、平行線維終末とのシナプス結合を失ったフリースパインがP15からP20の近位樹状突起に一過性に出現する。
　一体、平行線維シナプスを刈込む分子機構は何であるのか？平行線維シナプス刈込みが起こるP15～P20は、mGluR1シグナル伝達系による登上線維シナプスの後期刈込み過程の時期と一致することから、この伝達系にねらいを定めた。そこで、いつものように東京大学の饗場篤先生に連絡すると、mGluR1欠損マウスとPKCγ欠損マウスが供与された。予想は当たり、これらの欠損マウスではP15～P20に起こるべき平行線維シナプス刈込みが障害され、P30になっても支配テリトリーの分離は起こらなかった。反対に、ウイルスベクターを使ってmGluR1欠損マウスにmGluR1を導入すると、平行線維シナプス刈込みは回復した。
　これまでのこの伝達系の小脳回路発達研究や、mGluR1の機能や発現の低下を病因とする小脳脊髄変性症などの疾患研究を通して（Yamasaki et al., 2021）、シナプス刈込みやシナプス機能におけるmGluR1シグナル伝達系の役割と重要性について、繰り返し思い知らされている。