グリオキサールの化学構造

　グリオキサールglyoxalは、アルデヒド基（-CHO）を有する化学物質の1つで、その仲間で実験に活用されるものにホルムアルデヒドformaldehyde とグルタールアルデヒドglutaraldehyde（GLA）がある（図2）。
　ホルムアルデヒドは、アルデヒド基1個に水素原子が結合した最小のアルデヒド（化学式CH₂O、構造式HCHO）で、免疫組織化学やin situハイブリダイゼーションなどの光学顕微鏡レベルの組織化学に用いられる、最も標準的な化学固定剤である。この固定液の実験での使用に際して、2通りの作り方がある。1つはホルムアルデヒドが重合した粉末のPFAを加水分解して4%水溶液として使用するため、「4%PFA」と呼ばれる。もう一つが、38%のホルムアルデヒドを含有したホルマリン溶液を購入し、それを使用時に10倍希釈して用いるため、「10%ホルマリン」と呼ばれる。いずれも、ホルムアルデヒドを約4%含有するという点では同じであるが、作り方の違いにより２通りの呼称で通用している。
　一方、電子顕微鏡観察に使用されるもう一つのアルデヒド系固定剤がGLAである。こちらは分子の両端に2つのアルデヒド基を有するジアルデヒドで、その間を3個の炭素原子がリンカーとして繋いでいる（化学式C₅H₈O₂、構造式CHO(CH₂)₃CHO。この官能基の標的であるアミノ基に結合して分子間の重合を促進するため、GLAは代表的なクロスリンカー^*3であり、これが細胞小器官やシナプスなどの超微細構造の保持に役立つと考えられている。一方、GLAは分子の抗原性を著しく低下させることも広く知られている。このため超微細構造の観察用には2%PFA/2%GLAを用い、免疫電顕用には4%PFA/0.1%GLAを使うなど、使用目的に応じてGLA濃度を調節する。
　これに対して、グリオキサールは2つのアルデヒド基が背中合わせに結合した、ジアルデヒドとしては最小の分子である（C₂H₂O₂、構造式CHO-CHO）。従来、グリオキサールは、ゲノムDNAやRNAの検出（サザンブロット、ノザンブロット）の際に行われる核酸の電気泳動ゲル用変性剤として使用され、組織化学を目的とした化学固定剤として使用されることはなかった。

グリオキサールの有用性に関するRizzoli研からの報告

　組織化学のおけるグリオキサールの有用性を最初に報告したのは、ゲッチンゲン大学のシルビオ・リゾーリSilvio RizzoliのラボからEMBO Journalに出版された2018年の論文、「Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy（免疫染色および超解像度顕微鏡におけるホルムアルデヒドの代替固定剤としてのグリオキサール）」（Richter et al., 2018）である。彼らは、3%グリオキサール・8%エタノール・0.75%酢酸を混合した固定液と4%PFAを用いて、主に培養細胞におけるシグナル強度の比較から、以下の点を明らかにした。
1．グリオキサール固定液の方が、タンパク質や核酸に対する固定速度、固定力、クロスリンク能が高い。例えば、細胞活動が低下・停止するにつれ細胞内に取り込まれるpropidium iodideやFM1-43の色素取り込み速度を比較すると、グリオキサール固定細胞の方が早く取り込む。この効果はpH依存的で、固定液をpH4-5に調製することが必要である。
2．最も重要な発見は、多くの分子において蛍光抗体染色の強度が増強することを見出したことである。その効果を、欧米4カ国11の有名ラボにも依頼して、細胞小器官や細胞膜、細胞質などに分布する合計82種類の抗体による蛍光強度を客観的に比較検定した。その結果、グリオキサールの方が勝る抗体が51、4%PFAの方が勝る抗体が12、両者同等が19という結果であった。この中に、シナプス後部分子であるHomer-1とPSD-95に対する3種類の抗体が含まれ、グリオキサールの方が勝る抗体が2つ、両者同等が1つという軍配であった。

グリオキサール固定法に関する我々の研究成果

　抗原露出法・抗原賦活法に長年取り組んできた我々の立場からすると、抗体の浸透が最も阻害されているチャンピオンがNMDA型グルタミン酸受容体とその足場タンパク質PSD-95である。我々は、グリオキサールの方が勝る抗体にPSD-95抗体が含まれていたことに注目し、ラボの今野幸太郎助教を中心として、グリオキサールの可能性を検証することにした。選んだ抗体はNMDA受容体GluN1抗体とPSD-95抗体であり、翌日その威力を早速目にすることになった。4%PFA固定脳組織なら、抗原露出法なしでは全くシグナルが出てこないこれらの分子シグナルが、グリオキサール固定を用いると抗原露出法なしでも容易にシグナルを検出でき、しかもそのシグナル強度が高いのである。その後、6年間の検討結果を重ねて出版した論文のタイトルが、「Glyoxal fixation: An approach to solve immunohistochemical problem in neuroscience research（グリオキサール固定: 神経科学研究における免疫組織化学上の問題を解決するアプローチ」（Konno et al., 2023）である。後日、この論文の査読し評価してくれた3名のレフリーの一人がRizzoli自身であったことを知り、研究という営みを通して生産的なキャッチボールができたことを、心から嬉しく感じた。

グリオキサール固定法の効果

　主にマウス脳組織切片を用いて明らかにした、この論文の要点を列挙する。

1. 1．固定液の組成や検出手順を最適化した結果、9%グリオキサール・8%酢酸による灌流固定と、抗体希釈液と洗浄液への界面活性剤（0.1%Triton-X100）の添加が標準プロトコールとして確立した。
2. 2．4%PFA固定組織では抗原露出法・抗原賦活法を必要としていた分子（例えば、NMDA型グルタミン酸受容体やPSD-95）の検出は、グリオキサール固定組織では一切不要となる。つまり、通常の免疫組織化学のプロトコールで誰でも検出できるようになった。
3. 3．4%PFA固定組織では抗原露出法・抗原賦活法なしでも普通に検出可能な分子（例えば、神経終末の化学的マーカーとなる小胞膜伝達物質輸送体や代謝型受容体）の多くが、グリオキサール固定組織では蛍光シグナル強度が有意に増強する。1と2の効果により、検討した53分子のうち47分子で有意な増強効果が得られた（図3）。
4. 4．上記のシグナル増強効果は、包埋前および包埋後の免疫電顕法、パラフィン包埋切片においても確認できた。
5. 5．上記のシグナル増強効果は、マウスだけでなく霊長類のコモンマーモセット^*4の脳組織においても得られた。
6. 6．4%PFA固定組織に比べ、グリオキサール固定組織における抗体浸透度は著明に上昇した。さらに、組織透明化法^*5と組み合わせてレーザー光の散乱を防止すると、100ミクロンメートル厚の切片の全層にわたり、一様な蛍光シグナルを取得できた。
7. 7．従来、特異抗体ではないと判断されてきた一次抗体を、グリオキサール固定組織を用いて再検討すると、野生型組織で検出されノックアウト組織では検出されない特異的シグナルを得ることができた。論文ではそのような例として、ニューロリジン1抗体、GABA_A受容体γ2、GABA_B受容体2を紹介したが、実はもっともっとある。

今後のインパクトと問題点

　神経科学研究が対象とする神経組織は活発な情報伝達を行うため、シナプス後部、シナプス間隙、軸索初節、ランビエ絞輪などにイオンチャネルが密集し、そこに足場タンパクや補助サブユニットなどの多様な分子群がタイトに相互作用している。従来のホルマリン固定法では、抗原露出法・抗原賦活法が必要な分子と不要な分子を同時に検出しようとすると、得られるシグナルの深度に違いが生じた。例えば、抗原露出法・抗原賦活法が必要なシナプス後部のイオンチャネル型グルタミン酸受容体と、不必要なシナプス前部の小胞膜グルタミン酸輸送体を同時に検出すると、ペプシン処理などで組織表面を削られて露出し検出可能になる受容体のシグナルピークは、輸送体のそれと比べて切片の表面側に位置する。このため、本来はプレシナプスの輸送体とポストシナプスの受容体が向かい合うように検出されるはずなのだが、実際にはなかなか向かい合ってくれないのである。このため、論文に掲載する画像の取得には、字面には記載できないような深い経験と洞察を通して厳選された代表例を掲載しているのである。ところが、グリオキサール固定法により抗原露出法・抗原賦活法の要・不要がなくなると、関連分子がキチンと隣り合ったり、ピッタリと向かい合って検出できるようになった。今後、超解像顕微鏡法^*6や膨張顕微鏡法^*7などの高解像度イメージングと組み合わせることで、神経科学や細胞生物学の解析精度の向上が期待される。
　パラフィンへの包埋過程で組織に加えられる加熱や収縮等により、パラフィン切片を用いた免疫組織化学は凍結切片などを用いるものと比べて、シグナルが低下するのが一般的である。また、長期に渡るパラフィン切片の保存による組織の劣化で、さらに抗原性が低下する。この克服のため、病理学領域ではさまざまな抗原露出法・抗原賦活法が開発され、発展してきたのである。シグナル増強効果がパラフィン切片でも確認でき、霊長類のマーモセット脳組織でも確認でき、抗体の特異性を向上させる効果を考え合わせると、グリオキサール固定法が応用されるべきもう一つの大きな領域が、ヒトパラフィン切片を豊富に抱える病理学研究領域であると考える。これにより、病理診断の精度や信頼性の向上が期待される。
　一方、グリオキサール固定には、改善すべき問題点もある。従来のPFAやGLAによる固定組織の電子顕微鏡像では、細胞膜などの脂質二重層が黒く、それ以外の構成成分は白から黒までの間のさまざまな濃淡からなる電子顕微鏡特有のイメージ（これを灰調とよぶ）になる。優れた灰調を備えた電顕写真を撮影し提示できることが、電顕学者の冥利なのである。ところが、グリオキサール固定組織の電子顕微鏡像は膜系のコントラストが増強しすぎて灰調が損なわれ、さらに細胞質中に空白の領域が出現する。分子検出感度が上がるのはよいが、超微細形態像に劣るというのが、現時点でのグリオキサール固定法の最大の難点である。
　もう一つの問題点は、固定後の組織が柔らかいことである。これは抗体の組織浸透性が良い特性と表裏一体なのかもしれない。しかし、免疫組織化学の反応中に切片が破れるという実際上の問題がしばしば生じる。特に、脳組織では白質が破損しやすい。原法に比べてグリオキサールと酢酸の濃度をそれぞれ9%と8%に上げた理由が、シグナル損失を防ぎつつ組織硬度を上げることで、切片脆弱性も問題解決の一助とした訳である。

　研究者人生の駆け出しの頃に遭遇した大きな困難が、研究者人生の終わり近くになって氷解したという、私にとってはまるで小説「ぽっぽや^*8」の主人公・佐藤乙松のような感慨に浸っていることを、ご理解いただけたら幸いである。